Kaedah penyelidikan virologi

Diet

Kaedah penyelidikan virologi digunakan secara meluas dalam bidang perubatan untuk diagnosis pelbagai penyakit berjangkit dan beberapa penyakit onkologi yang bersifat virus.

Kaedah penyelidikan virologi juga digunakan untuk mengenal pasti virus, mengkaji biologi mereka dan keupayaan untuk bertindak ke atas sel haiwan dan manusia, yang seterusnya membantu memahami patogenesis penyakit virus dan memilih kaedah yang tepat untuk rawatan mereka. Di samping menubuhkan etiologi penyakit dan memantau keberkesanan terapi, kaedah penyelidikan virologi sangat penting dalam menentukan dan menjalankan langkah-langkah anti-wabak.

Kaedah penyelidikan langsung dalam virologi

Kaedah penyelidikan virologi secara langsung membolehkan mengesan virus, asid nukleik virus atau antigen virus secara langsung dalam bahan klinikal dan dengan itu adalah kaedah yang paling cepat (cepat - sehingga 24 jam). Kaedah ini kurang bermaklumat dan memerlukan pengesahan makmal tentang kaedah diagnosis tidak langsung berkaitan dengan pengambilan keputusan negatif palsu atau palsu. Terus termasuk kaedah penyelidikan berikut:

  • mikroskopi elektron dengan virus yang direndam oleh kontras yang negatif (membolehkan anda menentukan kehadiran virus dan kepekatannya dalam bahan, dengan syarat bahawa 1 ml mengandungi sekurang-kurangnya 105 zarah virus);
  • mikroskop elektron imun berdasarkan interaksi antibodi spesifik dengan virus dengan pembentukan kompleks yang lebih mudah untuk mengesan dengan kontras negatif daripada virus secara berasingan;
  • Enzim imunosorben yang berkaitan enzim (ELISA) menggunakan antibodi berlabel enzim yang mengikat antigen, membentuk kompleks yang dikesan dengan menambah substrat untuk enzim yang digunakan;
  • Reaksi imunofluoresensi (RIF) - secara langsung atau tidak langsung - adalah berdasarkan penggunaan antibodi yang berkaitan dengan pewarna neon;
  • analisis radioimun (RIA) adalah berdasarkan penggunaan antibodi label dan kaunter gamis yang diberi label radioisotop;
  • Kaedah sitologi adalah berdasarkan pemeriksaan mikroskopik smear berwarna, biopsi, bahan bedah siasat;
  • kaedah molekul - hibridisasi molekul asid nukleik dan tindak balas rantai polimerase (yang pertama adalah berdasarkan pengenalan helai nukleik pelengkap yang menggunakan label, yang kedua adalah berdasarkan prinsip mereplikasi urutan DNA spesifik virus dalam tiga peringkat).

Terdapat tiga pilihan untuk hibridisasi molekul asid nukleik - titik hibridisasi, pewarnaan hibrid (digunakan untuk mendiagnosis jangkitan HIV) dan hibridisasi in situ (secara langsung dalam sel-sel yang dijangkiti). PCR (tindak balas rantai polimerase) kini semakin digunakan dalam pemantauan dan diagnosis jangkitan virus disebabkan oleh kepekaan tinggi dan kekhususan kaedah ini.

Kaedah penyelidikan virologi tidak langsung

Kaedah-kaedah ini adalah berdasarkan pengasingan dan pengenalan virus. Ini lebih banyak memakan masa dan teknik yang panjang, namun lebih tepat. Bahan untuk kajian tersebut boleh menjadi kandungan vesikel, pengikatan (dengan cacar air, lesi herpetik kulit dan membran mukus), nasofaring terapi (dengan jangkitan pernafasan), darah dan minuman keras (dengan jangkitan arbovirus), najis (dengan jangkitan enteroviral), flushes (dengan campak, rubella, dan sebagainya). Disebabkan fakta bahawa virus dapat melipatgandakan hanya dalam sel hidup, penanaman virus itu dilakukan dalam kultur tisu, embrio ayam atau dalam haiwan (hamster, tikus putih, anjing, kucing, beberapa spesies monyet). Satu petunjuk yang dibawa oleh virus kesan cytopathic, dalam gemadsorbtsii balas pada sampel warna, keputusan hemagglutination perencatan, mengenai perubahan atau kurang daripadanya dalam embrio anak ayam atau budaya tisu, survival haiwan sensitif.

Kaedah diagnostik serologi yang digunakan dalam virologi

Di bawah diagnosis serologi merujuk kaedah penyelidikan virologi berdasarkan tindak balas antigen-antibodi. Dalam kes ini, serum yang paling biasa digunakan, yang diambil pada selang beberapa minggu. Dengan peningkatan titer antibodi 4 atau lebih kali, reaksi dianggap positif. Untuk menentukan jenis spesifisiti virus, reaksi peneutralan virus digunakan, untuk menentukan kekhususan kumpulan, tindak balas pelengkap mengikat. Juga digunakan secara meluas adalah tindak balas haemagglutination pasif, perencatan haemagglutination, invasi hemagglutination pasif, FTA, dan pelbagai pilihan untuk immunoassay enzim.

Baru-baru ini, satu teknik untuk menghasilkan antibodi monoklonal telah dibangunkan semasa penyelidikan kejuruteraan genetik. Khasiat spesifik monoklon diatasi dengan menggunakan beberapa antibodi monoklonal terhadap penentu virus yang berbeza. Ini meningkatkan kepekaan dan kekhususan kaedah penyelidikan virologi dengan penentuan antigen virus. Pada masa ini, banyak sistem ujian yang berbeza untuk diagnosis imunologi jangkitan virus telah dibuat.

Kaedah untuk kajian virus.

Secara bersejarah, virologi telah berkembang dari mikrobiologi, dan walaupun teknik mikrobiologi tidak dapat digunakan ketika bekerja dengan virus, prinsip umum seperti aturan aseptik, mendapatkan garis bersih, kaedah titrasi, dan akhirnya vaksinasi, membentuk asas sains baru. Kajian lebih lanjut mengenai sifat-sifat penting virus memerlukan pembangunan beberapa kaedah khas. Oleh itu, keupayaan virus untuk melalui penapis bakteria telah digunakan untuk menentukan saiz dan bersih, saiz kecil daripada virus merangsang penciptaan teknik mikroskopi lebih canggih. Arsenal teknikal virologi secara beransur-ansur diperkaya dengan kaedah fizik, kimia, genetik, sitologi, biologi molekul dan imunologi.

Virus mampu mengukur dan menimbang, menentukan komposisi kimia mereka, corak pembiakan, tempat mereka secara semula jadi, peranan mereka dalam berlakunya penyakit, serta membangunkan kaedah yang berkesan untuk memerangi jangkitan virus. Virus ditanam melalui kaedah khas, dengan menjangkiti haiwan makmal, embrio ayam dan budaya tisu. Pada awal virologi, kajian telah dijalankan ke atas haiwan makmal (tikus putih, babi guinea, arnab). Mereka telah menyuntik "bahan mencurigakan" dan diadili oleh gambar penyakit yang virus itu menyebabkannya. Untuk penghasilan semula dan pengasingan virus, sebagai tambahan kepada haiwan makmal, embrio ayam mula digunakan, di mana beberapa virus membiak dengan baik, terkumpul, kadang-kadang dengan kuantiti yang banyak.

Dari awal 50-an abad ke-20, satu kaedah kultur tisu telah dibangunkan: sel-sel tisu hidup dipisahkan menggunakan enzim, dipindahkan ke bekas steril khas, satu komposisi kompleks nutrien ditambah dan dimasukkan ke dalam termostat untuk pertumbuhan. Sel-sel mula membahagikan dan secara beransur menutupi permukaan kaca dengan lapisan yang berterusan. Jika sel-sel tersebut dijangkiti virus, maka anda dapat melihat secara langsung kesan merosakkannya. Kaedah kultur tisu membuat kemungkinan untuk menemui virus baru dan mengkaji interaksi virus dan sel.

Pengasingan, pembiakan dan penentuan spesies virus adalah kaedah utama virologi praktikal. Kerja ini biasanya terdiri daripada dua bahagian utama: kajian sel-sel yang dijangkiti virus, dan kajian terhadap virus yang terisolasi.

Untuk mengesan sel yang dijangkiti, pelbagai kaedah diagnosis virologi digunakan: kaedah antibodi pendarfluor, yang membolehkan dengan jelas menentukan kehadiran virus dalam sel yang kelihatan tidak dijangkiti secara luaran; kaedah mengambil kira kelajuan dan sifat penghasilan semula virus, berdasarkan pemusnahan (penuh atau separa) sel. Peranan penting dalam diagnosis jangkitan virus dimainkan oleh penentuan titres antibodi spesifik dalam serum pesakit yang menggunakan pelbagai tindak balas imunologi - peneutralan, mengikat pelengkap, menunda hemagglutination, dan sebagainya.

ΙΙ. Ciri-ciri struktur dan pembiakan virus

Untuk masa yang lama, kewujudan virus diadili oleh tindakan penyebab penyakit mereka. Ia adalah mungkin untuk melihat langsung virus hanya selepas penciptaan mikroskop elektron, memberikan peningkatan puluhan dan ratusan ribu kali. Ini berlaku kira-kira 50 tahun selepas penemuan virus.

Virus terbesar menghampiri saiz bakteria kecil, yang terkecil - hingga molekul protein besar, sebagai contoh, kepada molekul hemoglobin dalam darah. Dalam erti kata lain, antara virus mempunyai gergasi dan kerdil mereka. Untuk pengukuran virus menggunakan nilai bersyarat, dipanggil nanometer (nm). Satu nanometer adalah sejuta milimeter. Saiz virus yang berlainan berbeza dari 20 hingga beberapa ratus nm. Sebagai perbandingan, kita memberi nilai sel darah terkecil - sel darah merah, sama dengan 7000-8000 nm, iaitu. Virus adalah kurang daripada sel darah merah dan beratus-ratus kali. Dalam penampilan, mayat virus menyerupai kiub, batang, bola, polyhedra dan benang.

Virus mudah terdiri daripada protein dan asid nukleik. Bahagian yang paling penting dalam zarah virus - asid nukleik - ialah pembawa maklumat genetik. Jika sel manusia, haiwan, tumbuhan dan bakteria sentiasa mengandungi dua jenis asid nukleik - deoxyribonucleic - DNA dan ribonucleik - RNA, maka hanya satu jenis yang terdapat dalam virus yang berlainan - sama ada DNA atau RNA, yang merupakan asas klasifikasi mereka. Komponen penting kedua virion adalah bahawa protein berbeza dalam pelbagai virus, yang membolehkan mereka dikenali oleh reaksi imunologi.

Lebih kompleks dalam struktur, virus, sebagai tambahan kepada protein dan asid nukleik, mengandungi karbohidrat, lipid. Setiap kumpulan virus mempunyai set sendiri protein, lemak, karbohidrat dan asid nukleik. Sesetengah virus mengandungi enzim.

Setiap komponen virion mempunyai fungsi tertentu: kulit protein melindungi terhadap kesan buruk, asid nukleik bertanggungjawab untuk sifat keturunan dan berjangkit dan memainkan peranan utama dalam kebolehubahan virus, dan enzim terlibat dalam pembiakan mereka. Biasanya, asid nukleik terletak di pusat virion dan dikelilingi oleh kot protein, seolah-olah berpakaian. Kapsid terdiri daripada cara tertentu yang dibentuk oleh jenis molekul protein yang sama, yang membentuk bentuk geometri simetri bersama dengan asid nukleik virus. Dalam kes simetri padu, rentetan asid nukleik nukleus dipecut ke dalam bola, dan capsomeres dikemas rapat di sekelilingnya. Begitu diatur virus polio, penyakit kaki dan mulut, adenovirus, reoviruses, rhinoviruses, dan lain-lain. Dengan lingkaran (rod berbentuk) simetri virus nucleocapsid nukleik asid helai dipintal dalam lingkaran, setiap pergantian capsomeres yang diliputi rapat bersebelahan satu sama lain. Capsomeres struktur dan rupa virions dapat dilihat oleh mikroskop elektron.

Rajah 3. - Struktur struktur virus immunodeficiency manusia (1 - capsomera; 2 - genom; 3 - sampul lipoprotein (supercapsid); 4 - spesies glikoprotik)

Dalam virus yang kompleks, inti dalam bentuk helix terlipat erat ditutup dengan satu atau lebih cangkang luar, yang termasuk pelbagai bahan. Struktur semacam itu, contohnya, virus cacar, influenza dan parainfluenza. Terutama mengkaji struktur bakteria virus - bacteriophages (phages), yang terdiri daripada kepala dan ekor. Ekor phage berpakaian topi protein, di mana serat nipis panjang memainkan peranan penyedut ketika melampirkan zarah phage ke bakteria.

Tarikh ditambah: 2016-06-22; Views: 1281; PEKERJAAN PERISIAN ORDER

Kaedah penyelidikan virus

PENYELIDIKAN VIRUS - penyelidikan yang dijalankan untuk mendiagnosis jangkitan virus, untuk mengkaji patogen yang berkaitan, pengedaran mereka, serta dalam pengeluaran ubat-ubatan virus. Dalam makmal virologi (lihat) madu. mereka mengkaji kedua-dua virus manusia dan, dalam sesetengah kes, virus haiwan (contohnya, mengesan rabies pada anjing, memeriksa haiwan yang digunakan untuk pengeluaran persediaan virus). Kaedah penyelidikan mereka dan yang lain adalah serupa.

Salah satu peringkat utama V. dan. adalah pengasingan virus. Apabila mengasingkan virus dari orang, darah, pelbagai rahsia dan ekskreta, kepingan organ digunakan. Selalunya, darah diperiksa untuk penyakit arbovirus. Seluruh defisrin atau darah hemolyzed digunakan, unsur-unsur individu atau bekuan (di peringkat akhir penyakit). Virus rabies, epid, parotiditis, herpes simplex boleh didapati dalam air liur. Mencuci Nasopharyngeal digunakan untuk mengasingkan agen penyebab influenza, campak, psittacosis, rhinovirus, virus penyinaran pernafasan, adenovirus. Adenovirus juga terdapat di dalam cuci dari konjunktiva. Flushing diambil dengan membilas hidung dan tekak (secara berasingan) dan mencuci konjunktiva dengan larutan isotonik natrium klorida. Anda boleh mengelap saluran hidung dan bahagian belakang tekak yang dibasahi dengan sup. Bahan tidak steril dirawat dengan antibiotik (1000 IU penisilin dan streptomycin setiap 1 ml) selama 30 minit. Pelbagai enterovirus, adeno dan reovirus dibezakan daripada najis. Sampel dicairkan 1:10 dengan penampan fosfat, disentrifugasi dua kali selama 20 minit. pada 8000 rpm saya Antibiotik ditambah seperti di atas. Kurang kerap untuk V. dan. Ambil kandungan pustules (untuk cacar, cacar air, herpes) dan organ-organ punctate (untuk limfogranuloma venereal). Bahan bahagian hendaklah diambil secepat mungkin selepas kematian organisma. Ia disimpan sehingga masa kajian di t ° -20 ° dan di bawah. Untuk menjalankan V. dan. tisu dihancurkan (ditumbuk) dan penggantungan 10-20% disediakan pada larutan isotonik natrium klorida atau medium budaya untuk budaya sel. Ia disentri selama 20 minit. pada 1500 rpm; supernatan digunakan untuk kajian lanjut.

Untuk mengasingkan virus, haiwan makmal, embrio burung, kultur sel dan tisu dijangkiti. Haiwan berguna jika virus menyebabkan mereka mengalami gejala klinikal yang jelas penyakit atau perubahan patologi (contohnya, lumpuh, radang paru-paru, dan lain-lain). Dari tropisme virus bergantung kepada keberkesanan laluan pentadbiran bahan. Jangkitan yang digunakan secara meluas di bawah kulit, intraperitoneally dan intravena. Virus neurotropik dikesan apabila haiwan dijangkiti hemisfera serebrum (arboviruses, virus rabies, dll.), Sekelompok belalang visual (virus polio dalam eksperimen monyet), dan saraf tunjang. Virus cacar dan herpes boleh dikesan dengan memohon bahan kepada arnab pada kornea yang dijelaskan. Sesetengah virus mudah dikesan apabila disuntik ke ruang anterior mata (misalnya, virus hepatitis anjing dalam anak anjing). Jangkitan intranasal haiwan biasanya digunakan untuk mengkaji agen penyebab jangkitan pernafasan (penyerapan ke hidung haiwan anestetik atau pengenalannya dalam bentuk aerosol di ruang khas). Bahan dimasukkan ke dalam saluran pencernaan dengan makanan atau melalui mulut dengan jarum yang tumpul. Dalam kajian beberapa virus onkogenik, kaedah jangkitan hamster keemasan ke dalam membran mukus kantung pipi digunakan.

Bagi banyak virus, haiwan yang baru lahir dan penyedut lebih mudah terdedah daripada individu matang seksual. Tikus menyusu digunakan secara meluas untuk mengasingkan arbovirus dan virus Coxsackie (selepas jangkitan di otak). Sesetengah adenovirus mampu mendorong tumor oleh jangkitan subkutaneus hamster emas yang baru lahir. Kajian terhadap sejumlah virus burung dilakukan pada ayam-ayam kehidupan hari pertama.

Penggunaan embrio ayam mempunyai beberapa kelebihan. Tisu mereka yang tidak dibezakan mempunyai kepekaan yang luas terhadap banyak virus. Kehadiran jangkitan dinilai oleh kematian embrio, penampilan perubahan (ospin) pada membran chorion-allantoic (Gambar 1), pengumpulan hemagglutinin dalam cairan embrio dan antigen virus yang mengikat pelengkap. Embrio pada membran chorioallantoic (pada usia 11-12 hari dengan virus kumpulan cacar), dalam rongga allantoic dan amniotik (myxoviruses 10-11 hari tua), kantong kuning (pada umur 5-6 hari, patogen psittacosinosis, dan sebagainya) dijangkiti. Bahan jarang disuntik ke dalam otak dan intravena (ke dalam kapal membran). Dengan sebarang cara jangkitan, embrio boleh trauma, oleh itu, mati dalam 24-48 jam pertama. dikecualikan daripada perakaunan.

Untuk mengkaji kesannya terhadap virus kimia. bahan-bahan yang sangat mudah dembrirovannye telur, yang dikeluarkan embrio, tetapi dipelihara shell chorioallantoic. Virus dan bahan ujian dimasukkan ke dalam larutan isotonik 20 ml natrium klorida. Lubang dalam cangkuk ditutup dengan cap dengan tiub, di mana anda boleh mengambil sampel untuk analisis.

Apabila menilai eksperimen pada haiwan dan embrio burung, seseorang harus mengingati kemungkinan merangsang jangkitan laten di dalamnya atau mengasingkan virus laten.

Terutama digunakan secara meluas untuk pengasingan dan pengumpulan virus yang menggunakan budaya sel dan tisu (lihat). Kaedah ini boleh memupuk kebanyakan virus yang diketahui (lihat Penanaman virus). Sesetengah daripada mereka secara intensif telah terkumpul semasa jangkitan awal budaya, untuk penyesuaian orang lain beberapa petikan diperlukan. Pembiakan kebanyakan virus dalam kultur sel disertai dengan perkembangan kesan sitopatik. Dengan sifatnya, adalah mungkin untuk menilai sama ada virus tergolong dalam satu atau genus lain: picornaviruses menyebabkan pembulatan dan kedutan sel, adenovirus - pembentukan kluster dalam bentuk tandan anggur, myxovirus, dan virus herpetic - pembentukan sintetik multinuclear. Sejumlah virus tidak boleh ditanam di luar badan.

Pengeluaran semula beberapa virus (kumpulan cacar, myxo-dan arbovirus) dapat dikesan menggunakan hemadsorption, kerana sel-sel yang terjejas memperoleh keupayaan untuk menyerap eritrosit. Erythrocyte yang sesuai (manusia, monyet, guinea babi, ayam) pada kepekatan 0.4-0.5% diletakkan pada monolayer pada t ° 4 ° atau pada suhu bilik selama 20-30 minit. Erythrocytes diserap di seluruh budaya (misalnya, virus para-influenza) atau membentuk pulau (virus selesema, cendawan).

Pendaraban virus kadangkala dinilai dengan mengkaji cecair budaya pada haiwan (tanda kutip encephalitis) atau di CSC. Kehadiran virus yang tidak mempunyai aktiviti sitopatik kadang-kadang ditentukan oleh keupayaannya untuk mengganggu virus cytopathogenic. Oleh itu, dalam kultur sel embrio ayam yang dijangkiti virus leukemia avian, penghasilan semula virus sarcoma Rous menghambat. Untuk mengesan virus cirit-birit dan babi cholera ternakan bukan cytopathogenik, kaedah END (exaltation of Newcastle disease virus) dicadangkan - superinfeksi kultur virus penyakit Newcastle. Dengan tindakan bersama kedua-dua virus, kemusnahan sel berlaku.

Apabila perubahan sitopatik atau tanda-tanda pembiakan virus lain berlaku, cecair kebudayaan digunakan untuk mengenal pasti virus atau laluan. Sejumlah virus masih dikaitkan dengan sel walaupun semasa degenerasi budaya (adenovirus, virus kumpulan cacar), akibat daripada pembekuan dan pencairan budaya dilakukan sebelum mengumpul cecair. Sesetengah virus herpetic, contohnya, virus penyakit Marek dalam ayam, perlu ditanam semula bersama dengan sel-sel utuh.

Untuk mengkaji virus pernafasan pernafasan manusia dan beberapa yang lain, mereka menggunakan kaedah kultur tisu, iaitu, jangkitan serpihan tisu vitro berbudaya. Penggunaan yang paling umum adalah tisu trakea. Virus pembiakan menjangkiti sel endotelium mukosa, yang ditentukan oleh pemberhentian pergerakan silia.

Pertimbangan harus diberikan kepada kehadiran virus luaran dalam budaya dan sel tisu. Mereka boleh digunakan dengan sel-sel, jika diambil dari organisma yang dijangkiti, dari trypsin atau serum yang digunakan untuk kultur sel.

Selain biopsi pembenihan atau bahan keratan pada budaya yang sudah dewasa, penanaman langsung sel-sel organ yang dikaji digunakan selepas trypsinization, yang sering lebih berkesan dari segi pengasingan virus (contohnya pengesanan adenovirus dalam tonsil). Kaedah budaya campuran juga digunakan apabila sel-sel organ yang ditemui tumbuh bersama-sama dengan mana-mana sel yang sensitif terhadap virus ini (contohnya, pembenihan sel-sel otak pesakit dengan panencephalitis sclerosing subacute bersama-sama dengan sel ginjal monyet atau sel Hela untuk mengasingkan virus campak). Kaedah budaya campuran sering merupakan satu-satunya cara untuk mengasingkan virus daripada tumor yang disebabkan oleh haiwan yang tidak menghasilkan virus aktif, tetapi mengandungi genom virus.

Satu budaya sel lapisan tunggal memungkinkan untuk mendapatkan koloni virus - plak (Rajah 2). Sebagai peraturan, plak membentuk virus dengan aktiviti sitopatik. Pada masa yang sama, kaedah ini membolehkan pengesanan beberapa virus bukan cytopathogenic (contohnya, beberapa jenis virus cirit-birit ternakan). Untuk mendapatkan plak, virus itu digunakan pada sel monolayer dalam cawan atau vials rata. Pelbagai jangkitan, iaitu bilangan zarah virus per sel, mesti kecil supaya plak yang terbentuk tidak bergabung. Selepas 30-60 minit Media penyerapan lapisan nutrien dengan 1.35 - 1.5% agar dan merah neutral dalam pencairan akhir 1: 40 000. Budaya dalam masakan Petri diinkubasi dalam atmosfera dengan 5-10% karbon dioksida, dan botol hermetically dimeteraikan dalam termostat konvensional. Selepas beberapa hari, tiang-tiang yang tidak berwarna dari sel-sel degenerasi mula menonjol di kalangan sel-sel berwarna vivo.

Ia adalah mungkin untuk meletakkan agar tanpa merah neutral pada sel-sel, dan selepas beberapa hari memohon lapisan kedua dye agar; plak menjadi kelihatan selepas beberapa jam. Agar kadang-kadang mengandungi sulfat polisakarida, yang merupakan penghambat pertumbuhan virus; Untuk meneutralkan mereka, protinine sulfat (60 mg setiap 100 ml) ditambah kepada medium. Untuk mendapatkan plak beberapa virus, metilcellulosa dan bahan lain boleh digunakan sebagai salutan. Sesetengah virus (cacar, campak) membentuk plak walaupun tanpa agar. Kaedah plak membenarkan analisis clonal strain virus. Untuk mengasingkan klon homogen secara genetik, satu plak dikeluarkan, yang digunakan untuk jangkitan seterusnya. Biasanya pengklonan dijalankan untuk tiga petikan.

Kaedah plak juga sesuai untuk menentukan bilangan sel yang menghasilkan virus dalam budaya yang dijangkiti (iaitu bilangan pusat berjangkit). Untuk melakukan ini, sel-sel itu digantung, diletakkan pada satu budaya lapisan tunggal sel indikator sensitif virus, dan dituangkan dengan agar. Bentuk Plak di sekeliling sel yang dijangkiti.

Untuk mendiagnosis jangkitan virus dan mengkaji struktur antigenik virus, reaksi pemendakan gel digunakan. Agar paling kerap digunakan untuk tujuan ini. Antigen dan antibodi tertentu, diletakkan pada gel agar pada jarak tertentu, meresap dan membentuk pada pertemuan yang mendakan dalam bentuk jalur putih. 0.8-1% agar dalam larutan isotonik natrium klorida atau penampan fosfat diletakkan di dalam kapilari atau diletakkan pada slaid kaca. Antigen disukai telah dibersihkan dan tertumpu. Bahan tindak balas diterapkan pada agar di hujung yang berlawanan kapilari atau di telaga yang dibuat di lapisan agar pada gelas pada jarak 5-6 mm. Inkubasi berlangsung 4-20 jam.

Sejumlah besar B. dan. melaksanakan mikroskop cahaya dan elektron. Virus terbesar (contohnya, cacar) selepas pemprosesan yang sesuai (perak, lukisan Victoria dan lain-lain) boleh dikesan oleh mikroskop cahaya konvensional. Kaedah ini digunakan dalam diagnosis cacar dengan memeriksa bahan dari pustules. Ciri-ciri beberapa jangkitan adalah pembentukan sel dalam sel - kemasukan. Oleh itu, kemasukan muncul dalam nukleus dalam kes jangkitan herpes dan adenovirus, dalam sitoplasma - dalam cacar (anak Guarnieri) dan rabies (Babesh body - Negri). Pengesanan kemasukan adalah penting untuk diagnosis rabies, cacar, sitomegali, subacute sclerosing panencephalitis, dll.

Mikroskopi dalam medan gelap (lihat mikroskopi Darkfield) dan mikroskopi fasa-kontras (lihat) menggunakan hl. arr. untuk mengkaji dinamik perubahan sel-sel yang dijangkiti virus. Mikroskopi pendarfluor yang lebih banyak digunakan (lihat).

Periksa smear, cetakan dan budaya sel tunggal yang ditanam di kaca. Persediaan (asli atau tetap) paling sering diwarnai dengan acridine oren. Kaedah ini membolehkan untuk mengesan virus besar dan kluster komponen virus. Formasi yang mengandungi cahaya DNA dengan cahaya hijau terang, dan yang mengandungi RNA adalah bata-merah. Selalunya dengan V. dan. membuat pemprosesan sel yang dijangkiti dengan antibodi pendarfluor, yang membolehkan anda mengenal pasti kumpulan antigen virus. Dalam kaedah langsung, gamma globulin imun yang dilabelkan dengan pewarna fluoresen, contohnya, fluorescein isothiocyanate, digunakan. Dalam kaedah tidak langsung, ubat ini dirawat dengan serum imun yang normal bagi mana-mana haiwan, dan kemudian dilabelkan dengan antibodi terhadap gamma globulin haiwan ini. Persiapan diperiksa dalam cahaya ultraviolet, antigen virus dikesan oleh cahaya hijau cahaya (lihat Immunofluorescence). Kaedah smear dari nasopharynx membolehkan diagnosis awal jangkitan virus pernafasan - influenza, parainfluenza, rhino- dan adenoviral, pernafasan pernafasan.

Mikroskop elektron (lihat) membolehkan anda mengkaji saiz dan struktur zarah virus, serta perubahan halus yang menyebabkannya dalam sel. Periksa selera virus atau bahagian ultrathin sel yang dijangkiti. Sesetengah virus (contohnya, serangkaian manusia dan haiwan pada onkaviruses) hanya boleh dikesan dalam tisu dengan kaedah ini.

B. dan., Tujuannya untuk menentukan jumlah (titer) virus atau antibodi virus, adalah sangat pelbagai.

Di bawah mikroskop elektron, adalah mungkin untuk mengira bilangan zarah virus dalam penggantungan, jika ia cukup bersih. Virus ini dicampur dengan getah polistirena, bilangan zarah diketahui. Campuran disembur pada grid, mengira bilangan zarah dalam titisan berasingan. Nisbah jumlah zarah lateks dan virus mendedahkan jumlah virion dalam jumlah tertentu. Kaedah ini tidak memberi gambaran mengenai aktiviti menular virus, kerana penggantungan virus biasanya mengandungi sejumlah besar zarah yang tidak berjangkit.

Paling tepat menentukan bilangan unit berjangkit dalam bahan yang membolehkan kaedah plak. Satu budaya sel lapisan tunggal menjangkiti dos kecil virus. Titer dinyatakan dengan bilangan unit pembentuk plak (PFU) dalam 1 ml. Dengan cara yang sama, adalah mungkin untuk menentukan titer dari beberapa virus onkogenik oleh tumpuan transformasi, serta patogen yang membentuk cacar pada membran chorioallantoic embrio anak ayam (misalnya, virus cacar).

Penentuan titer virus dengan kaedah pencairan terhingga kurang tepat. Secara berterusan meningkatkan pencairan (biasanya sepuluh kali ganda) disuntik ke dalam haiwan sensitif, dalam embrio ayam atau budaya sel. Memandangkan keputusan setiap pentadbiran sebagai positif atau negatif, mereka menentukan dos terendah virus yang boleh menyebabkan kesan tertentu (penyakit atau kematian haiwan, penampilan perubahan sitopatik dalam budaya, dll.). Dalam amalan, dos ini sukar ditentukan, oleh itu, kirakan dos, yang memberikan kesan 50% (ED50). Ia ditentukan bergantung kepada sifat-sifat virus dan kaedah titrasi oleh bilangan haiwan mati (LD50), bilangan kes (ID50), jumlah embrio di mana Hemagglutinins virus atau antigen-pengikat yang melambangkan muncul, mengikut bilangan budaya sel, di mana perubahan sitopatik atau aktiviti pembasmian darah telah dikesan. Titer dinyatakan dengan bilangan ED50 dalam jumlah bahan tertentu.

Daripada kaedah sedia ada untuk mengira ED50, kaedah Reed-Munch berdasarkan prinsip kumulatif adalah yang paling biasa digunakan. Ia berasaskan kepada andaian bahawa setiap objek ujian (tetikus, embrio) yang memberi tindak balas positif kepada pengenalan pencairan ini, akan bertindak balas dengan reaksi positif terhadap pengenalan virus yang lebih pekat. Sebaliknya, jika pencairan ini menyebabkan tindak balas negatif, maka dengan pengenalan pencairan yang lebih besar akan ada juga reaksi negatif. Selang antara pencairan dengan kaedah ini harus sama, sekurang-kurangnya 4 hewan (budaya) dijangkiti dengan setiap pencairan. Seterusnya, interpolate antara dos, yang menyebabkan kesannya paling hampir kepada 50%. Pengiraan dibuat mengikut formula:

di mana B adalah dos terkecil yang menyebabkan kesan lebih besar daripada 50%, b adalah kesan dos B dalam peratus, dan kesan dos tertinggi yang menyebabkan kesan kurang daripada 50%, dalam peratus, d ialah selang antara logaritma dua dos yang bersebelahan.

Virus yang mempunyai aktiviti sitopatik yang ketara (contohnya, virus polio) boleh dititrasi dengan menggunakan ujian warna. Ia didasarkan pada fakta bahawa semasa pertumbuhan sel pH medium menurun, dan dalam budaya yang dijangkiti, di mana sel-sel merosot, pH medium tidak berubah. Untuk mengenal pasti perubahan ini, penunjuk ditambahkan ke medium - fenol merah, yang merah pada pH di atas 7, oren pada pH 7 dan kuning pada pH di bawah 7. Dalam medium nutrien yang mempunyai pH 7.3-7.4, fenol merah diperkenalkan pada kepekatan akhir 1: 40,000. Dosis minimum sel yang mengubah warna medium dari merah ke kuning (biasanya kira-kira 25,000 dalam 0.25 ml) ditentukan. Seterusnya, sediakan pencairan 10 kali ganda virus, yang masing-masing dituangkan ke dalam 4-6 tiub, yang menambah penggantungan sel. Tiub ditutup dengan penyumbat getah atau tuang 0.6-0.8 ml minyak vaseline. Hasilnya diambil kira selepas disimpan selama 5-7 hari pada t ° 37 °. Titer virus diambil sebagai pencairannya, yang menghalang pH dari beralih ke sisi berasid dalam 50% tiub ujian.

Keupayaan sera imun untuk meneutralkan aktiviti menular virus ditentukan menggunakan tindak balas peneutralan. Kaedah titrasi serum ditentukan oleh kaedah titisan untuk virus masing-masing. Kesemua mereka didasarkan pada penyediaan campuran virus dengan serum, yang kemudian diuji untuk kehadiran virus yang dinetralkan. Reaksi ditetapkan dalam dua versi. Menurut salah satu dari mereka, serum imun dan normal dalam satu pencairan (misalnya, 1:10) dicampurkan dengan peningkatan 10 kali ganda pelarutan virus dalam jumlah yang sama dan titer virus ditentukan dengan kehadiran satu dan serum yang lain. ED quotient50 virus dengan kehadiran serum normal pada ED50nya dengan kehadiran satu kekebalan akan menjadi indeks peneutralan suatu pencairan yang diberikan serum imun. Adalah mustahil untuk menginterpolasikan hasil ini untuk serum serum yang lain (contohnya, aktiviti serum tidak ternyata akan lebih tinggi daripada yang dikira). Secara alternatif, dos yang berterusan dari virus (biasanya kira-kira 100 ED50) bersambung dengan beberapa pencairan 2 kali ganda daripada serum ujian. Titer serum akan dicairkan, dengan virus Crimea menyebabkan kesan 50%.

Bergantung pada kaedah titrikan virus, tindak balas peneutralan dilakukan pada haiwan makmal, embrio ayam (selepas kematian mereka atau pengumpulan hemagglutinin), pada budaya sel (pada penampilan perubahan sitopatik, ujian warna, dan sebagainya). Jika virus membentuk ospin pada membran chorioallantoic embrio anak ayam, pencairan serum tertinggi ditentukan, yang mengurangkan bilangan ospin sebanyak 50 peratus atau lebih. Begitu juga, serum dititri dengan mengurangkan bilangan plak virus pada budaya sel monolayer.

Titrasi virus oleh DSA dan antibodi oleh rtga didasarkan pada keupayaan beberapa virus (myxoviruses, beberapa ahli pirus, adenovirus, picornavirus, dan virus togavirus) untuk mengepam sel darah merah. Virus ini dititrasi dalam dua kali ganda pelepasan dengan jumlah yang sama 0.5-1% penggantungan eritrosit. Untuk titer (1 AE - aglutinasi unit) mengambil pencairan yang paling besar, yang menyebabkan hemagglutination (lihat). Titer virus haemagglutinating bukan merupakan penunjuk aktiviti yang menular, kerana hemagglutination) boleh menyebabkan zarah "tidak lengkap" yang tidak berjangkit, virus tidak aktif dan antigen Hemagglutinating yang boleh dipisahkan daripada virus tertentu. Sera RTGA dititikberatkan dalam dua kali ganda cecair dengan 2-4 virus AE; titer dianggap sebagai pencairan terbesar, menghalang hemagglutination sepenuhnya).

Sesetengah virus terserap pada sel darah merah, tetapi tidak menyebabkan aglutinasi mereka. Untuk mengenal pasti mereka, anda boleh menggunakan reaksi hemagglutination tidak langsung. Ia didasarkan pada aglutinasi eritrosit yang dimuatkan dengan virus dengan serum khusus untuk virus ini. Kaedah ini digunakan terutamanya untuk titration sera.

Tindak balas fiksasi pelengkap (lihat) sesuai untuk titrasi kedua-dua virus (lebih tepatnya, anti-virus antigen yang mengikat pelengkap) dan antibodi. Secara asasnya, CSC dengan virus tidak berbeza dengan antigen bakteria dan lain-lain. Perbezaan wujud hanya dalam kaedah penyediaan antigen. Darah, pembedahan nasofaring, urin, najis pesakit, penggantungan organ yang dijangkiti, bahagian embrio ayam yang dijangkiti dan virus yang ditanam dalam budaya sel boleh berfungsi sebagai antigen virus. Antigen kebudayaan yang paling sesuai. Suspensi organ-organ yang dijangkiti sebelum digunakan berulang kali dibekukan dan dicairkan, digabungkan dengan jumlah eter atau kloroform yang sama, digoncang selama 1-2 jam, kemudian diinkubasi selama 18-20 jam. pada t ° 4 °, beku semula, cair dan meringankan dengan sentrifugasi. Untuk mendapatkan serum, haiwan tidak boleh diimunisasi dengan virus berbudaya dalam substrat yang sama seperti antigen untuk tindak balas. Bergantung pada tujuan titrasi, pelarutan ganda antigen digabungkan dengan dos tertentu serum atau, sebaliknya, dua kali ganda serum serum dengan satu dos antigen. Hubungan antigen, serum dan pelengkap dilakukan selama 1 jam pada t ° 37 ° atau 18 jam. pada t ° 4-6 °. Selepas menambah sistem hemo, bahan diinkubasi selama 30 minit. pada t ° 37 °. Penilaian keputusan yang dihasilkan oleh peraturan umum.

Terdapat kaedah untuk menetaskan virus dan antibodi berdasarkan petunjuk virus dalam sel-sel kuman yang dijangkiti dengan antibodi pendarfluor, serta beberapa yang lain yang jarang digunakan.

Kesan toksik yang terdapat pada virus nek mata kepada virus terungkap dengan pengenalan kepada haiwan dosis yang besar dengan cara yang luar biasa, di Krom virus tidak melewati kitaran penuh pembiakan. Jadi, sebagai contoh, virus selesema disuntik ke dalam tikus di otak atau intravena. Kesan toksiknya dinilai oleh kematian haiwan pada hari pertama.

Aktiviti antigenik virus (atau vaksin) ditubuhkan oleh imunisasi manusia atau haiwan, diikuti dengan penentuan titer antibodi dalam serum mereka. Aktiviti immunogenik vaksin, iaitu keupayaan untuk mendorong ketahanan terhadap jangkitan, ditentukan oleh imunisasi haiwan sensitif terhadap virus. Kemudian, haiwan yang diimunisasi dan mengawal haiwan yang tidak diimunisasi dijangkiti dengan satu siri pengurangan virus, mendefinisikan ED50 untuk kedua-dua kumpulan. Perbezaan dalam indikator yang diperolehi mencirikan imunogenikiti ubat ujian. Sekiranya virus itu tidak mempunyai patogenisiti untuk haiwan, imunogenikat vaksin yang sama boleh ditentukan hanya dalam epidemiol. pengalaman.

Untuk mengkaji beberapa ciri-ciri virus (saiz, struktur, komposisi kimia, dan lain-lain), perlu mempunyai bahan suci dengan titer yang tinggi. Virus yang paling biasa digunakan dalam kultur sel atau dalam bentuk cecair allantoic embrio ayam yang dijangkiti. Pembersihan biasanya bermula dengan sentrifugasi pembezaan: pertama, pada 15-20 ribu g (pecutan graviti), bahan dibebaskan dari serpihan selular, dan pada 50-100 ribu g - virus itu sendiri dicetuskan. Penapisan melalui gasket asbestos (seperti Seitz), penapis kaca dan selulosa (seperti penapis millipore) juga digunakan untuk menghilangkan zarah besar. Fragmen yang lebih kecil daripada virus boleh dikeluarkan dengan menapis bahan melalui gel Sephadex, yang, bergantung pada saiz liang, mengekalkan zarah saiz tertentu. Salutan dengan bantuan ammonium dan natrium sulfat, pemendakan dengan alkohol, aluminium hidroksida atau polietilen glikol digunakan untuk mengasingkan dan menumpukan virus dari jumlah besar. Untuk pembebasan daripada protein balast, pencernaan mereka dengan enzim proteolitik juga digunakan. Myxoviruses boleh disucikan dan tertumpu oleh penjerapan pada eritrosit pada suhu rendah dengan elusi pada yang lebih tinggi.

Pemurnian dan kepekatan lebih lanjut virus yang dihasilkan oleh satu atau kaedah fraksinasi lain. Kaedah ini juga digunakan untuk memisahkan mutan virus dan komponen virus individu. Apabila virus dicampur dengan sistem fasa yang dibentuk oleh larutan berair daripada dua polimer, ia melepasi satu fasa bergantung kepada saiznya, komposisi ionik medium, pH, dan lain-lain. Untuk pembersihan virus besar, mereka biasanya menggunakan sistem dextran sulfate - metilcellulosa, kecil - dextran sulfate dengan polietilena glikol. Polimer yang tinggal selepas pemisahan fasa sering dikeluarkan semasa proses pemurnian lagi virus. Anda juga boleh mengeluarkan dextran sulfate dengan menambahkan kalium klorida, metil selulosa dengan amonium sulfat, klorofil polietilena glikol, dan kaedah lain.

Pemurnian virus menggunakan kromatografi lajur adalah berdasarkan keupayaan mereka untuk menyerap sejumlah bahan, dan untuk menghindari dari mereka apabila menukar pH atau kepekatan garam (lihat Kromatografi). Gel kalsium fosfat, penukar ion berasaskan sel (kebanyakan penukar anion, contohnya, diethylaminoethyl cellulose), resin pertukaran ion digunakan untuk penjerapan. Pengelompokan virus dari kalsium fosfat dilakukan dengan penyelesaian penampan fosfat yang meningkatkan kepekatan, dan dari penukar ion asas berasaskan sel dengan larutan natrium klorida.

Suspensi yang disucikan dengan sangat baik diperolehi dengan menyentrangi cecair dalam tiang dengan ketumpatan yang diedarkan dalam kecerunan berterusan. Zarah virus dikumpulkan pada tahap di mana kepadatan medium adalah sama dengan ketumpatan terapungnya. Sentrifugasi zonal dalam kecerunan sukrosa membolehkan pemisahan zarah dengan massa yang berbeza. Bahan ini digunakan untuk kecerunan yang dihasilkan dengan melapisi penyelesaian sucrose yang bersamaan. Pada akhir sentrifugasi, pecahan dikumpulkan, menindik bahagian bawah tiub. Dalam keseimbangan atau sentrifugasi isopik, zarah virus digantung dalam larutan sesium klorida, sesesium sulfat atau rubidium klorida. Selepas sentrifugasi yang berpanjangan, kecerunan kepadatan berterusan berterusan dibuat. Mengikut laman penyetempatan zarah virus, ketumpatan mereka boleh ditentukan. Perlu diingatkan bahawa nilai yang diperolehi daripada kepadatan dan jisim zarah virus pada tahap tertentu bergantung kepada medium yang digunakan dalam sentrifugasi.

Apabila V. dan. Virus yang dilabelkan dengan pelbagai isotop radioaktif digunakan secara meluas. Karbon yang paling biasa digunakan adalah 14 C, tritium 3 H, fosforus 32 P, sulfur 35 S, iodin 131 I. Ia adalah yang paling mudah untuk menandakan virus apabila ia ditanam dalam budaya sel. Radioaktiviti ditentukan menggunakan kaunter cemilik cecair atau autoradiografi (lihat).

Chem. komposisi virus diperiksa kimia konvensional. dengan kaedah. Nukleus ke-yang biasanya menerima pengekstrakan fenol, detergen anionik kurang kerap digunakan - dodecyl - atau natrium lauril sulfat.

Untuk mengenal pasti virus (lihat), pertama sekali anda harus menentukan identiti jantina mereka. Untuk melakukan ini, perlu menentukan saiz dan struktur zarah virus, jenis asid nukleik dalam komposisi mereka, kehadiran membran lipoid. Jenis asid nukleik paling sering ditentukan oleh kaedah tidak langsung, contohnya, dengan menggunakan keupayaan bromodeoxyuridine untuk menekan pembiakan virus yang mengandungi DNA. Kehadiran sampul lipoid dalam virus ditentukan oleh kepekaannya terhadap tindakan eter dan kloroform (virus dengan amplop tidak aktif). Pengenalan selanjutnya dilakukan dengan set siri imun terhadap virus yang diketahui, menggunakan pelbagai tindak balas - peneutralan, CSC, rtga, dan lain-lain. Tidak lazimnya, haiwan diimunisasi dengan virus yang diketahui dan dijangkiti lebih lanjut dengan yang tidak diketahui atau sebaliknya.

Bibliografi: Diagnosis makmal penyakit virus dan rickettsial, ed. E. Lennet dan N. Schmidt, trans. dengan bahasa Inggeris, M., 1974, bibliogr.; Luria G. E. dan Darn Ell J. E. Umum Virologi, trans. dari bahasa Inggeris., M., 1970, bibliogr.; Kaedah Virologi dan Biologi Molekul, trans. Dengan bahasa Inggeris, M., 1972; П ш и н ба ч-в в V. А., Semenov B.F. iZeze-r mengenai EG. Standardisasi kaedah penyelidikan virologi, M., 1974, bibliogr.; Garis panduan untuk diagnosis makmal penyakit virus dan rickettsial, ed. P. F. Zdrodovsky dan M. I. Sokolov, M., 1965; Sokolov MI, Sini et al. Untuk A.I. dan Remezov P.I Kajian virologi dan serologi dalam jangkitan virus, L., 1972; Virologische Praxis, hrsg, v. G. Starke, Jena, 1968, Bibliogr.

Kaedah penyelidikan virus

Ciri khas kaedah penyelidikan virus. Inti, nilai dan penggunaan mikroskop elektron dan imunoelektron, kekhususan kaedah immunofluorescence. Keterangan kaedah hibridisasi molekul. Skim mikroskop elektron.

Hantar kerja yang baik dalam asas pengetahuan adalah mudah. Gunakan borang di bawah.

Pelajar, pelajar siswazah, saintis muda yang menggunakan asas pengetahuan dalam kajian dan kerja mereka akan sangat berterima kasih kepada anda.

Dihantar pada http://www.allbest.ru/

Kementerian Pendidikan dan Sains Persekutuan Rusia

Institusi Bajet Persekutuan Pendidikan Tinggi Profesional

Fakulti Sains

Jabatan Botani dan Genetik

Kaedah penyelidikan virus

Selesai: Evteeva D.S.

KAEDAH PENYELIDIKAN VIRUS

MICROSCOPY ELEKTRONIK VIRUS

METODE HYBRIDIZATION MOLECULAR

SENARAI LITERATUR YANG DIGUNAKAN

Virus sebagai parasit intraselular tidak dapat berkembang pada media nutrien buatan. Mereka hanya boleh membiak dalam organisma tuan rumah yang terdedah atau dalam sel sensitif virus hidup.

Organisma host yang terdedah untuk kajian virus digunakan dalam kes-kes di mana tidak ada sistem percubaan untuk mengkaji patogenesis jangkitan virus, ketika menguji keselamatan vaksin virus atau keselamatan spesifik virus dadah. Di samping kelebihan yang jelas, kaedah ini mempunyai kelemahan dan batasan yang berkaitan dengan kesukaran penyeragaman dan kebolehulangan hasil, serta kerana kos eksperimen yang agak tinggi.

Budaya sel yang diperkenalkan dalam amalan penyelidikan pada tahun 1940-an secara radikal mengubah arsenal virologi metodologi.

Pada masa ini, kaedah budaya adalah asas dalam virologi eksperimen dan praktikal.

Kaedah penyelidikan yang digunakan dalam virologi adalah kerumitan yang besar, yang disebabkan terutamanya oleh parasitisme intraselular mutlak virus dan saiznya yang kecil.

KAEDAH PENYELIDIKAN VIRUS

Kaedah penyelidikan yang digunakan dalam virologi adalah kerumitan yang besar, yang disebabkan terutamanya oleh parasitisme intraselular mutlak virus dan saiznya yang kecil.

Dalam kajian bahan-bahan yang diperolehi daripada pesakit dengan jangkitan virus, untuk tujuan diagnosis makmal penyakit-penyakit ini, pelbagai kaedah digunakan:

· Kaedah mikroskopi elektronik dan immunoelectron;

· Kaedah hibridisasi molekul;

· Kaedah imunofluorensi;

· Pengesanan antibodi kelas lgM.

MICROSCOPY ELEKTRONIK

Mikroskopi elektron adalah kaedah untuk mempelajari struktur yang berada di luar skop mikroskop cahaya dan mempunyai dimensi kurang daripada satu mikron (dari 1 mikron hingga 1 - 5 A).
Tindakan mikroskop elektron (APL.1.RIS.1) didasarkan pada penggunaan aliran elektron berarah, yang memainkan peranan rasuk cahaya dalam mikroskop cahaya, dan peranan lensa dimainkan oleh magnet (kanta magnetik).

Disebabkan fakta bahawa bahagian-bahagian yang berlainan objek dalam kajian menahan elektron dengan cara yang berbeza, imej hitam dan putih objek yang sedang dikaji diperolehi pada skrin mikroskop elektron, puluhan yang diperbesarkan dan ratusan ribu kali. Dalam biologi dan perubatan, mikroskop elektron jenis transmisi digunakan terutamanya.

Mikroskopi elektron berasal pada tahun 1930-an, apabila imej pertama sesetengah virus (virus mozek tembakau dan bakteria) diperolehi. Pada masa ini, mikroskop elektron telah menemui aplikasi terluas dalam sitologi, mikrobiologi dan virologi, yang membawa kepada penciptaan cawangan baru sains. Mikroskop elektron objek biologi menggunakan kaedah khas untuk penyediaan dadah. Ini adalah perlu untuk mengenal pasti komponen individu objek yang dikaji (virus itu), serta untuk mengekalkan struktur mereka di bawah keadaan vakum yang tinggi di bawah rasuk elektron.

Dengan bantuan mikroskop elektron, bentuk luaran objek, organisasi molekul permukaannya dikaji, dan struktur dalaman objek disiasat menggunakan kaedah bahagian ultrathin.

Mikroskop elektron dalam kombinasi dengan kaedah penyelidikan biokimia, sitokimia, imunofluorensi, serta analisa struktur sinar-X membolehkan untuk menilai komposisi dan fungsi unsur-unsur struktur sel-sel dan virus.

Mikroskopi elektron virus yang bernoda oleh kaedah kontras negatif, membolehkan anda membezakan virus dan menentukan kepekatan mereka. Penggunaan mikroskop elektron dalam diagnosis jangkitan virus adalah terhad kepada kes di mana kepekatan zarah virus dalam bahan klinikal adalah agak tinggi (105 dalam 1 ml dan ke atas).

Kelemahan kaedah ini ialah ketidakupayaan untuk membezakan virus kepunyaan kumpulan taksonomi yang sama. Kelemahan ini disingkirkan dengan menggunakan mikroskop elektron imun.

Kaedah ini didasarkan pada pembentukan kompleks imun dengan penambahan serum spesifik kepada zarah virus, sementara terdapat kepekatan serentak zarah virus, yang membolehkan mereka dikenalpasti. Kaedah ini juga digunakan untuk mengesan antibodi. Untuk tujuan diagnostik yang jelas, pemeriksaan mikroskopik elektron terhadap ekstrak tisu, najis, cecair dari vesikel, dan rembesan dari nasofaring dilakukan.

Mikroskop elektron digunakan secara meluas untuk mengkaji morfogenesis virus, keupayaannya diperluas apabila menggunakan antibodi berlabel.

MICROSCOPY IMMUNELECTRONIC

Ini adalah gambaran langsung interaksi antigen dan antibodi oleh mikroskop elektron, pertama kali dicadangkan untuk kajian virologi oleh J. Almeida dan A. Vatson pada tahun 1969.

Secara metrik, ujian IEM dilakukan dalam urutan berikut:

1. Bahan yang menganggap kehadiran virus yang diingini, dicampur dan diinkubasi dengan serum imun standard;

2. Kompleks antibodi-virus dihidupkan dengan sentrifugasi dalam mod yang sesuai;

3. Bahan yang berbeza ditambah kepada sedimen yang disokong semula, dan persiapan yang dihasilkan diperiksa di bawah mikroskop elektron.

Dalam kes reaksi positif, agregat ciri yang terdiri daripada zarah virus yang saling terhubung oleh jambatan antibodi dikesan. Ambang sensitiviti IEM adalah rendah: pengesanan virus dipercayai boleh dipercayai apabila kepekatannya dalam bahan permulaan adalah 10 ^ 4 - 10 ^ 6 partikel per ml.

Kelebihan kaedah ini adalah keupayaan untuk menilai bukan sahaja hasil reaksi serologi, tetapi juga untuk mengenal pasti substrat morfologinya, iaitu, untuk menentukan bentuk dan saiz zarah virus. Di hadapan persiapan virus dengan kandungan zarah IEM yang diketahui, ia juga boleh digunakan untuk penentuan kuantitatif antibodi dalam sera, yang mana sistem khas telah dicadangkan untuk mengira intensiti interaksi virus dan antibodi.

Kaedah serologi dalam virologi adalah berdasarkan kepada tindak balas imunologi klasik: tindak balas yang mengikat tindak balas, perencatan hemagglutination, penolakan biologi, immunodiffusion, hemagglutination tidak langsung, hemolisis radial, immunofluorescence, immuno-enzyme, radioimmunoassay. Mikromethods yang dihasilkan oleh banyak reaksi, peralatan mereka sentiasa diperbaiki.

Kaedah ini digunakan untuk mengenal pasti virus menggunakan set sera dan serodiagnosis untuk menentukan pertumbuhan antibodi dalam serum kedua berbanding dengan yang pertama (serum pertama diambil pada hari pertama selepas penyakit, kedua - dalam 2 - 3 minggu). Tidak kurang daripada empat kali ganda peningkatan antibodi dalam serum kedua adalah kepentingan diagnostik. Jika pengesanan antibodi kelas lgM menunjukkan jangkitan baru-baru ini, maka antibodi kelas lgC berterusan selama beberapa tahun, dan kadang-kadang untuk hidup. Untuk mengenal pasti antigen individu virus dan antibodi kepada mereka dalam campuran yang kompleks tanpa pembersihan awal protein, imunoblotting digunakan.

Kaedah ini menggabungkan fraksinasi protein menggunakan elektroforesis gel polyacrylamide diikuti oleh imunoindikasi protein melalui kaedah ELISA. Pemisahan protein mengurangkan keperluan untuk kemurnian kimia antigen dan memungkinkan untuk mengenal pasti pasangan antigen-antibodi individu. Tugas ini adalah relevan, sebagai contoh, dalam serodiagnosis jangkitan HIV, di mana ujian-ujian immunoassay enzim positif palsu disebabkan oleh adanya antibodi untuk antigen selular yang hadir akibat pemurnian protein yang tidak mencukupi.

Pengenalpastian antibodi dalam sera pesakit kepada antigen virus dalaman dan luaran membolehkan menentukan peringkat penyakit, dan dalam analisis populasi - variasi protein virus.

Immunoblotting untuk jangkitan HIV digunakan sebagai ujian pengesahan untuk mengenal pasti antigen dan antibodi virus individu kepada mereka. Apabila menganalisis populasi, kaedah ini digunakan untuk menentukan kebolehubahan protein virus.

Nilai besar kaedah ini terletak pada kemungkinan menganalisis antigen yang disintesis menggunakan teknologi DNA rekombinan, menentukan saiznya dan kehadiran penentu antigen.

mikroskop hibridisasi molekul virus

Kaedah imunofluoresensi, atau tindak balas imunofluoresensi (RIF), digunakan dalam makmal mikrobiologi yang dilengkapi dengan mikroskop fluoresen.

Kajian ini menggunakan tindak balas imunofluoresensi langsung dan tidak langsung.

Apabila digunakan untuk diagnosis imunofluoresensi langsung, bahan klinikal yang tetap dengan etanol digunakan untuk slaid kaca.

Kemudian tambah serum fluoresen. Periksa ubat di bawah mikroskop neon.

Reaksi imunologi antigen-antibodi berlaku secara langsung pada slaid. Sebagai contoh, antigen influenza, yang digabungkan dengan immunoglobulin berlabel, di bawah mikroskop mempunyai penampilan zarah-zarah bercahaya yang terletak di dalam nukleus dan sitoplasma sel-sel yang dijangkiti. Kaedah ini mudah, tetapi ia memerlukan serum fluoresen untuk setiap jenis antigen.

Inti dari tindak balas imunofluoresensi tidak langsung adalah bahawa antigen pertama terikat pada serum (tanpa label) tertentu pada slaid. Serum luminescent ditambah kepada kompleks antigen-antibodi yang terbentuk pada kaca.

Peringkat terakhir adalah mikroskop, yang mengenal pasti kompleks berlabel.

Kaedah ini menggunakan sedikit sera pendarfluor, jadi ia digunakan secara meluas untuk mengesan jangkitan bakteria, rickettsial, pneumocystic.

Ia memudahkan untuk mengenal pasti virus influenza, parainfluenza, adenovirus, virus penyinaran pernafasan, sitomegalovirus. Diagnostik jangkitan legionella dan klamidia juga perlu dibuat menggunakan ujian immunofluorescence untuk menentukan antigen yang sepadan.

METODE HYBRIDIZATION MOLECULAR

Kaedah hibridisasi molekul, berdasarkan pengenalpastian asid nukleik spesifik virus, membolehkan untuk mengesan satu salinan gen dan tidak sama dengan tahap sensitiviti.

Reaksi ini berdasarkan kepada hibridisasi helai DNA atau RNA (probe) dan pembentukan struktur double-stranded. Siasatan paling murah mengkloning DNA rekombinan. Siasatan dilabelkan dengan prekursor radioaktif (biasanya fosforus radioaktif). Penggunaan perspektif tindak balas warna.

Terdapat beberapa pilihan untuk hibridisasi molekul: bertitik, hibridisasi blot, hibridisasi sandwic, hibridisasi in situ, dan lain-lain.

SENARAI LITERATUR YANG DIGUNAKAN

1) diagnosis makmal jangkitan virus, N.N. Nosik, V.M. Stakhanov

2) Institut Virologi. D. Dan Ivanovsky RAMS, Moscow; Diagnosis Makmal Jangkitan Virus, N.N. Nosik, V.M. Stachanova

3) Atlas anatomi dan ontogenesis virus manusia dan haiwan, A. A. Avakyan, A. F. Bykovsky, 1970

4) Planet Virus, Karl Zimmer, 2012

5) http://www.serdechno.ru/enciklopediya/3171.html